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2022-11-023066 次瀏覽
細胞凍存與復(fù)蘇

一、如何處理收到的細胞

1.新買的或惠贈的細胞如何處理?

不管買的細胞、惠贈的細胞,剛拿到手應(yīng)趕緊做這幾件事:檢測瓶子是否破裂;培養(yǎng)基是否漏出,是否渾濁;是否有支原體污染;迅速擴增凍存。


2.能否使用與原先培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基?

不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應(yīng)的細胞培養(yǎng)基,若驟然使用和原先提供培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基,細胞大都無法立即適應(yīng),造成細胞無法存活。


3.購買的細胞死亡或存活率不佳可能原因?

常見原因可能有:培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳;血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳;解凍過程錯誤;冷凍細胞解凍后,加以洗滌細胞和離心;懸浮細胞誤認為死細胞;培養(yǎng)溫度使用錯誤;培養(yǎng)箱氣體濃度達不到要求;細胞置于–80℃太久。


二、復(fù)蘇凍存的細胞

1.收到的冷凍管瓶身破裂,瓶蓋有裂紋,或瓶蓋脫落的原因?

冷凍管瓶蓋裂紋,或瓶身破裂,可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當(dāng),造成冷凍管裂損,建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫,是因熱脹冷縮的物理現(xiàn)象,冷凍管有可能因此而造成細胞污染,故冷凍管于放入和取出液氮桶時,均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊。


2.冷凍管應(yīng)如何解凍?

將冷凍管由液氮桶中取出解凍時,必須注意安全,可佩戴防護眼鏡和手套預(yù)防冷凍管的爆裂。取出冷凍管后,須立即放入 37 ℃ 水浴環(huán)境中快速解凍,輕搖冷凍管使其在 1 分鐘內(nèi)全部融化,避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成損害。并注意水面不可超過冷凍管蓋沿,否則易發(fā)生污染情形。


3.細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時,是否應(yīng)馬上去除 DMSO?

現(xiàn)在大多數(shù)實驗室會在解凍細胞后加培養(yǎng)液將DMSO出去,但也有研究者認為除少數(shù)特別注明對 DMSO 敏感的細胞外,絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞),在解凍之后,可直接放入含有 10~15 ml 新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)角瓶中,待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除 DMSO 即可,如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附的問題。


三、細胞培養(yǎng)用液

1.如何正確選擇培養(yǎng)基種類?

培養(yǎng)基主要包括天然細胞培養(yǎng)基、合成細胞培養(yǎng)基和無血清細胞培養(yǎng)基等。

天然細胞培養(yǎng)基:是人們早期采用的細胞培養(yǎng)基,直接取自于動物組織提取液或體液,如血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸出液等。水解乳蛋白和膠原是兩種較好的天然培養(yǎng)基,富含氨基酸。血清是天然培養(yǎng)基中最有效和最常用的培養(yǎng)基,血清的來源有胎牛血清、小?;虺膳Q?、馬血清、雞血清、羊血清及人血清,最廣泛應(yīng)用的為胎牛血清和小牛血清。


合成細胞培養(yǎng)基:是用化學(xué)成分明確的試劑配制的培養(yǎng)基,組分穩(wěn)定,主要包括糖類、必需氨基酸、維生素、無機鹽類等。由于細胞種類和培養(yǎng)條件不同,適宜的合成細胞培養(yǎng)基也不同,在動物細胞培養(yǎng)中最常用基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基有6~7 種,如BME、MEM、DMEM、HAM F12、PRMI1640、199 等。

無血清細胞培養(yǎng)基:是指在使用中無需添加血清的細胞培養(yǎng)基,且其組成成分不含有任何動物組分。按照其組分分類,還可以分為無動物組分無血清細胞培養(yǎng)基和化學(xué)限定無血清細胞培養(yǎng)基,前者組分中可能含有某些植物來源成分,而后者完全由化學(xué)成分明確的組分組成。


其中,無動物組分無血清細胞培養(yǎng)基是目前在生物制藥行業(yè)中應(yīng)用最廣泛的,它提高了細胞培養(yǎng)的質(zhì)量,避免了使用血清帶來的麻煩。目前,已有多種無血清培養(yǎng)基上市,如雜交瘤細胞無血清培養(yǎng)基、CHO細胞無血清培養(yǎng)基、Vero細胞無血清培養(yǎng)基和NS0 細胞無血清培養(yǎng)基等。


2.什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅?

酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為 PH 值的指示劑:中性時為紅色,酸性時為黃色,堿性時為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用(特別是雌激素)。為避免固醇類反應(yīng),培養(yǎng)細胞,尤其是哺乳類細胞時,用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測,一些研究人員在做流式細胞檢測時,不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。


3.細胞培養(yǎng)基的配制和儲存應(yīng)該注意什么?

細胞培養(yǎng)基配好后,要先抽取少許放入培養(yǎng)瓶內(nèi)在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置24~48h,已檢測培養(yǎng)液是否有污染,然后方可用于實驗。配置培養(yǎng)基所需的血清要合格并且保持穩(wěn)定。一個批號試用效果良好后,就可一次購入較多同一批號的血清,這樣實驗條件穩(wěn)定,配液時調(diào)整pH值較容易。每次配液量以使用兩周左右的量為宜,一次配液不要太多,一是短期內(nèi)用不完造成營養(yǎng)成分損失需要補充,二是量大易造成污染。


4. 為何培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中,顏色會偏暗紅色?

培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中,培養(yǎng)基內(nèi)的 CO2 會逐漸溢出,造成培養(yǎng)基越來越偏堿性,而培養(yǎng)基中的酸堿指示劑 (通常為 phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿的結(jié)果, 將造成細胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時,可以通入無菌過濾 CO2,以調(diào)整 pH 值。


5.可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的血清種類?

不能。血清是細胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源,所以血清的種類和品質(zhì)對于細胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清,在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同,血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。


6.血清滅活是否必須?

這個問題現(xiàn)在有爭議。有人主張價格不菲的血清中含有諸如生長因子,維生素,氨基酸等珍貴物質(zhì),而將它們置于50℃以上的溫度長達30分鐘的熱處理會對血清中的生長因子,氨基酸等成分帶來的負面影響。盡管如此,在大多數(shù)實驗室之中血清的熱滅活還是作為常規(guī)來執(zhí)行,尤其是在昆蟲細胞和胚胎干細胞培養(yǎng)中。


7.培養(yǎng)基中是否添加抗生素?

除特殊篩選系統(tǒng)中外,一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下,培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。


8.何時更換培養(yǎng)基?

視細胞生長密度而定,或遵照細胞株基本數(shù)據(jù)上的更換時間,按時更換培養(yǎng)基即可。


四、細胞傳代

1.細胞傳代的方法都有哪些?

根據(jù)不同的細胞采取不同的方法。貼壁生長的細胞用消化法傳代;部分貼壁生長的細胞用直接吹打即可傳代;懸浮生長的細胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代,或用自然沉降法吸除上清后,再吹打。


2.原代培養(yǎng)的首次傳代應(yīng)注意的問題?

細胞沒有生長到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前,不要急于傳代;原代培養(yǎng)時細胞多為混雜生長,不同的細胞有不同的消化時間,因此要根據(jù)需要注意觀察及時處理,并根據(jù)不同細胞對胰蛋白酶的耐受時間而分離和純化所需要的細胞;吹打細胞時動作要輕巧盡可能減少對細胞的損傷;首次傳代時細胞接種數(shù)量要多一些,使細胞能盡快適應(yīng)新環(huán)境而利于細胞生存和增值;隨消化分離而脫落的組織塊也可一并傳入新的培養(yǎng)瓶。


3.使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的?應(yīng)如何處理?

EDTA作用較胰蛋白酶緩和,主要作用在于能從組織生存環(huán)境中吸取Ca2+、Mg2+,這些離子是維持組織完整的重要因素。但EDTA單獨使用不能使細胞完全分散,因而常與胰蛋白酶按不同比例混合使用,效果較好。常用比例為1:1或者2份EDTA:1份胰蛋白酶。EDTA的工作液濃度為0.02%,用不含Ca2+、Mg2+的BSS配置。如果使用EDTA,在終止消化前,需用緩沖液將消化液清除后才能加培養(yǎng)液。第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中,保存于 –20 ℃,避免反復(fù)冷凍解凍造成胰蛋白酶的活性降低,并可減少污染的機會。


4.欲將一般動物細胞離心下來,其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速?

欲回收動物細胞,其離心速率一般為800~1000 rpm,5~10 分鐘,過高的轉(zhuǎn)速,將造成細胞死亡。


5.細胞的接種密度為何?

依照細胞株基本數(shù)據(jù)上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長的重要原因之一。


6.細胞交叉污染的可能原因?

多種細胞系進行維持傳代操作時,各細胞系所需的器材和溶液沒有嚴(yán)格分開,往往會使一種細胞被另一種細胞污染。


五、細胞凍存

1.冷凍培養(yǎng)基為什么要加DMSO?

因為細胞在不加任何保護劑的情況下直接凍存時,細胞內(nèi)外的水分都會很快形成冰晶,冰晶的形成將造成細胞損傷,還可引起細胞的的死亡。目前多采用甘油和DMSO做保護劑。這兩種細胞無明顯毒性,分子量小,溶解度大,易穿透細胞,可以使冰點下降,提高包膜對水的通透性。


2.DMSO 的等級和無菌過濾的方式為何?

冷凍保存使用的 DMSO 等級,必須為 Tissue culture grade 的 DMSO,其本身即為無菌狀況,第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中,保存于 4 ℃,避免反復(fù)冷凍解凍造成 DMSO 的裂解而釋出有害物質(zhì),并可減少污染的機會。若要過濾 DMSO,則須使用耐 DMSO 的 Nylon 材質(zhì)濾膜。


3.欲冷凍保存時,細胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細胞濃度?

冷凍管內(nèi)細胞數(shù)目一般為 1x106 cells/ml vial,融合瘤細胞則以 5x10^6 cells/ml vial 為宜。


4.冷凍保存細胞的方法?

冷凍保存方法一:冷凍管置于 4 ℃ 30~60 分鐘 →-20 ℃ 30 分鐘 → -80 ℃ 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽 vapor phase 長期儲存。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序的可程序降溫機中每分鐘降 1~3 ℃ 至 –80 ℃ 以下, 再放入液氮槽 vapor phase 長期儲存。–20 ℃ 不可超過 1 小時,以防止冰晶過大,造成細胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入 –80 ℃ 冰箱中,存活率稍微降低一些。


5.細胞凍存太多會不會浪費?

每一種細胞系都應(yīng)有充足的凍存儲備,防止由于細胞污染等因素造成的細胞系的絕種,而且每一批次培養(yǎng)的細胞狀態(tài)都不同,應(yīng)該挑選幾個狀態(tài)較好的批次凍存保種。另外二倍體細胞等有限細胞系如果暫時不用應(yīng)凍存以免傳代太多,造成細胞衰老或者發(fā)生改變。

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