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實(shí)驗(yàn)材料：

DMEM高糖培養(yǎng)基

FBS/NBS

HT選擇培養(yǎng)基

CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱

細(xì)胞計數(shù)器

單通道移液槍、多通道移液槍

相差顯微鏡

生物安全柜

10μL、200μL、1000μL吸頭

96/24/6孔細(xì)胞培養(yǎng)板

15mL、50mL無菌離心管

100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿

T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶

96孔酶標(biāo)板

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：

陽性對照：

融合前采對應(yīng)實(shí)驗(yàn)的小鼠眼球血，37℃放置2h，然后4℃放置2h，最后10000rpm離心10min，取上清，-20℃條件下保存。（使用前提前解凍，稀釋1000倍備用）

陰性對照：

各個階段培養(yǎng)基留5ml左右，作為陰性對照用。

Elisa檢測板準(zhǔn)備：

將對應(yīng)抗原用CB以1μg/ml濃度加入96孔酶標(biāo)板內(nèi)（100μl/孔），4℃過夜靜置包被。用1×PBST洗板2遍，清洗結(jié)束，加入封閉液封閉，37℃封閉1h，用1×PBST洗板2遍，拍干水分，4℃短期保存，-20℃長期保存。

實(shí)驗(yàn)流程：

融合檢測：

細(xì)胞融合換液后，等4~7天，觀察細(xì)胞融合狀態(tài)，大部分細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)出現(xiàn)小細(xì)胞團(tuán)，即可開始檢測。

用排槍取融合培養(yǎng)上清100μL/孔至包被好的Elisa檢測板中，因?yàn)?span lang="EN-US">Elisa檢測板來源于外部，切記從細(xì)胞培養(yǎng)板中單次取液，不可反復(fù)吸取，取一次液換一次槍頭，防止污染細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞，以及交叉污染影響檢測結(jié)果。（每塊板預(yù)留一孔陽性對照孔，一孔陰性培養(yǎng)基對照孔）

根據(jù)陰性對照和陽性對照的OD值，確定陽性孔，取陽性對照OD值得一半以上的數(shù)值為陽性。

第一次亞克?。?/span>

根據(jù)融合檢測的數(shù)據(jù)，挑選陽性孔，將陽性孔中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至24孔板中培養(yǎng)擴(kuò)增，根據(jù)細(xì)胞生長情況2~3天后采用Elisa方法復(fù)檢，防止假陽性。

挑選24孔板中復(fù)檢陽性的孔，進(jìn)行細(xì)胞復(fù)懸，使細(xì)胞在培養(yǎng)基中分散均勻。用細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)，計數(shù)完成后，根據(jù)計數(shù)情況比例稀釋細(xì)胞懸液，按照1個/孔的密度均勻鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，一個陽性克隆株鋪一塊細(xì)胞培養(yǎng)板板。[一次亞克隆采用FBS-DMEM(HT),培養(yǎng)基的血清使用濃度略低于融合時的濃度，略高于SP2/0常規(guī)培養(yǎng)濃度，可按照5% 進(jìn)行區(qū)分]

畫克隆：

一次亞克隆后，融合細(xì)胞在CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4~5天后，采用相差顯微鏡逐孔觀察，在單孔內(nèi)有且只有一個正圓形細(xì)胞團(tuán)的孔，即為單克隆細(xì)胞孔，做好標(biāo)記。若無無單克隆孔，則挑選細(xì)胞團(tuán)較少的多克隆細(xì)胞孔，做好標(biāo)記。

一次亞克隆檢測：

畫克隆后，繼續(xù)培養(yǎng)3~5天，根據(jù)細(xì)胞生長情況，采用Elisa法進(jìn)行一次亞克隆檢測，優(yōu)選挑選陽性單克隆孔，若無陽性單克隆孔，則挑選克隆數(shù)較少的陽性多克隆孔。挑選出來的細(xì)胞株轉(zhuǎn)移至24孔擴(kuò)增培養(yǎng)，進(jìn)行陽性克隆株復(fù)篩，確保挑選的細(xì)胞株非假陽性。

二次亞克?。?span lang="EN-US">

將一次亞克隆挑選出來的細(xì)胞株，重復(fù)一次亞克隆步驟。細(xì)胞培養(yǎng)基換成FBS-DMEM，培養(yǎng)基的血清使用濃度調(diào)整成SP2/0的常規(guī)培養(yǎng)濃度。

畫克隆

二次亞克隆后4~5天，進(jìn)行畫克隆，單克隆孔做好標(biāo)記。

二次亞克隆檢測：

畫克隆后，繼續(xù)培養(yǎng)3~5天，重復(fù)一次亞克隆檢測步驟，挑選陽性單克隆細(xì)胞株，準(zhǔn)備進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。

建株：

陽性單克隆細(xì)胞株需進(jìn)行至少2次的亞克隆，檢測為全陽方可建株！若為了保證穩(wěn)定性，建議進(jìn)行第三次亞克隆。

挑出兩次檢測均為單克隆且全為陽性后，在24孔板中培養(yǎng)擴(kuò)增，2~3天后用Elisa法進(jìn)行交叉檢測（主要針對帶標(biāo)簽的蛋白抗原）和穩(wěn)定性鑒定。

檢測合格后挑選一個細(xì)胞狀態(tài)，長勢較好且陽性OD值較高的細(xì)胞株，轉(zhuǎn)移至6孔板進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，2~3天后，用亞型檢測試劑盒進(jìn)行抗體亞型鑒定。

完成以上鑒定后，將單克隆細(xì)胞株轉(zhuǎn)移至100m細(xì)胞培養(yǎng)皿或者T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行大量擴(kuò)增。

擴(kuò)增完成后將單克隆細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞凍存，標(biāo)記好細(xì)胞名稱、凍存者、凍存日期等信息，放置凍存盒中，轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱，一天后轉(zhuǎn)移至液氮罐中儲存。

凍存后一周再復(fù)蘇檢測，防止細(xì)胞株出現(xiàn)產(chǎn)抗不穩(wěn)定現(xiàn)象，若檢測沒有問題，則將細(xì)胞株錄入細(xì)胞庫中，并撰寫實(shí)驗(yàn)報告。（細(xì)胞凍存3支/株，且3支確保有2個及以上凍存批次，避免出現(xiàn)凍存失誤，細(xì)胞株丟失）